大家都看过越狱吧，想当初小编为了看帅锅MichaelScofield也是轰轰烈烈不眠不休几天追完整个剧情，各中激动忐忑犹然在心，不知是否您也与小编同感，虽然只是一部剧，但其中的心酸与精彩让人记忆犹新，其实在现实生活中也有很多类似的场景在上演着，且医院携手百迈客生物如何探索结核杆菌的梦幻逃亡之路。
文章名称
microRNA-20aInhibitsAutophagicProcessbyTargetingATG7andATG16L1andFavorsMycobacterialSurvivalinMacrophageCells
合作单位：医院
发表期刊：FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology
影响因子：IF=5.
测序平台：IlluninaHiseqSE=50nt
研究背景
当机体被分枝杆菌感染时，自噬在宿主免疫应答过程中起着重要的防御作用。然而，在面对宿主的免疫应答反应时，分支杆菌可以住进巨噬细胞并通过调节自噬反应进而躲避宿主的攻击。miRNA在转录后调控中起着关键的精细调控作用，然而在结核杆菌感染期间是否有特意性的miRNA对于巨噬细胞自噬作用的启动有影响未见研究和报道。本研究可以帮助我们对更深入的理解结核菌感染相关疾病的发病机理。
结果概述
研究结果表明：BCG感染的巨噬细胞导致了miRNA-20a表达量的上升，miRNA通过靶向ATG7和ATG16L1基因的表达从而抑制自噬过程，并藏于巨噬细胞最终躲过宿主细胞的攻击。迫于miRNA-20a的过度表达，降低了巨噬细胞中自噬相关蛋白LC3-II的表达和LC3的数目，最终促进了BCG在巨噬细胞中的存在，同时转染了miRNA-20a抑制剂组出现了相反的情况。对于这个结果研究者后期通过透射电子显微镜分析，通过siRNA阻断及过表达等实验得到了相同的结果，也再次证明了结果的可靠性。
取样思路
组织类型：小鼠巨噬细胞（RAW.7细胞）
处理方法：使用5mM的三甲基腺嘌呤（3-MA）和50μg/ml的雷帕霉素（Rapa）处理RAW.7细胞样本数量：3个，分别为对照组NC处理组3-MA和Rapa
分析思路
1.数据挖掘之基因筛选
关键调控miRNA初筛
按照套路来，首先分析了处理组与对照组的差异表达miRNA,在本研究中共找到显著性差异的miRNA共90个。基于差异表达的miRNA进行聚类热图分析，如下图所示：
进一步分析发现在这些差异表达的miRNA中，其中的52个表达量为升高的miRNA，差异倍数在1.5倍以上，其余的为下调，差异倍数大部分在2倍以上，如下图：
聚类分析中发现：miRNA-19-92cluster（包括miRNA-20a）参与了自噬调控的另外一种细胞模型，暗示出该cluser可能与巨噬细胞的自噬调控相关。其中miRNA-20a在3-MA组下调，在Rapa组上调，可能就是与巨噬细胞自噬相关的关键调控miRNA。
关键调控miRNA精筛（精华提炼）
接下来的进一步筛选，以ATG（autophagy-relatedproteins）为主线，在GO数据库中基于生物学过程分类进行筛选，通过靶基因预测，筛选出19个miRNA信息，其中的12个在本项目中为差异表达的miRNA（包括miRNA-20a），最后靶向定位出20个ATGs.在筛选获得的miRNA中，7个在差异分析中FC值是略高于1.5倍或者比0.5倍略低（miR-20a,miR-92a,miR-,miR-,miR-a,miR-96,miR-），4个miRNA（miR-17,miR-18a,miR-19a,miR-19b）是在miR-17-92cluster聚类时筛到，另外的8个miRNA是已知的与自噬相关的miRNA.其中作为候选的潜在的调控基因miR-20a（FC≥1.5倍）是通过miRWalk软件预测获得。在初筛的基础上进一步缩小范围，同时获得了与初筛相同的结果。
在上升的3个miRNA中，仅有miRNA-20a在RaDa处理上升，同时在3-MA处理时下调。
靶基因预测
通过4款软件（miRWalk,miRDB,miRanda和Targetscan）进行靶基因预测，共获得个潜在的靶标基因（没有同时做mRNA测序，靶基因预测数会较多正常现象）。看到这里有些人员急了，接下来怎么办？不要慌，还有绝招。
进一步功能注释最终筛选出2个基因ATG7和ATG16L1与自噬相关。
19个miRNA与20个ATGs互作
2.数据挖掘之miRNA-20a如何发挥调控作用？
经miRanda和TargetScan软件分析，发现miRNA-20a主要通过与ATG16L1和ATG7基因的3’端结合进而抑制ATG16L1和ATG7基因的翻译过程，进而调控巨噬细胞的自噬过程。
3.功能验证
首先验证测序结果准确性：通过qPCR验证，结果与测序结果一致。
其次验证功能：
主要通过过表达及抑制剂两种方法进行验证：通过minic和抑制剂验证，发现miRNA-20a确实可以抑制ATG16L1和ATG7基因的表达，结果如下：
通过TEM验证了miR-20a可以抑制自噬过程，结果如下图：
ＰＳ：关键名词解释
1.结核分枝杆菌（M.tuberculosis）简称结核杆菌（tuberclebacilli）。早在年，德国细菌学家郭霍就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。
2.雷帕霉素(Rapamycin)：自噬诱导剂，诱导细胞自噬发生。3-甲基腺嘌呤：自噬抑制剂。加入雷帕霉素或3-甲基腺嘌呤，自噬相关蛋白会有明显变化，影响自噬过程。
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